摘要：取代烷基吡嗪除了从咖啡豆、可可豆、坚果和蔬菜等各种天然来源中提取之外，还可以使用传统的化学方法或在某些微生物的帮助下合成。由于人们对即食食品、咖啡和巧克力饮料的需求增加，吡嗪对食品工业的重要性预计将在未来几年增长；由于吡嗪的取代位置和浓度，这种烘烤、坚果和泥土的味道让人联想到咖啡和可可。人们对日常食物的成分和来源的意识日益增强，“有机”和“天然”等标签对市场产生了强烈的影响。近年来，许多用生物技术方法制备的香原料征服了市场，并注定要取代和优化从植物或动物来源中提取的成分(如0.01%吡嗪/kg生物量)。本文综述了吡嗪合成的研究进展和面临的挑战。主要部分介绍了糖蜜天然产物的提取、化学合成、微生物发酵和生物催化制备方法。不同类型的生产对最终产品的申报和价值具有决定性作用，合成生产的2,5-二甲基吡嗪和天然提取的2,5-二甲基吡嗪分别为200和3500美元/公斤。
1、引言
从糖蜜中提取吡嗪的简史
人类一直对自己吃的食物着迷。历史上，草药和香料被用来改善味道和延长食物的保质期。后来，油炸、烹饪和烘焙等热加工标志着改变食品性质和风味的开始，而与高温下引发的有机反应无关。现代有机化学的出现和对食品香料不断增长的需求——从草莓到香草——都是化学合成香料出现在我们的食物中的原因。其中许多都是在化学、微生物学、生物化学和遗传学的进一步成就的帮助下，受到自然发酵过程的启发。为了满足全球需求，必须取得进一步进展。例如，全世界的草莓产量只能满足少量草莓风味的产品，如草莓果酱、乳制品、冰淇淋、洗发水、房间香水等。通常用化学或生物合成香料来丰富风味[与Axxence Slovakia s.r.o的个人咨询]。
今天，大多数风味料都是通过化学合成或从天然来源中提取的。然而，市场分析显示，消费者倾向于渴望“天然”或至少含有“天然风味”的产品，这意味着成分来自天然来源，如香辛料、水果或蔬菜的成分将日益受到关注(见欧盟法规第2.4章的部分内容(EEC No 1334/2008))。法规的立法因国家而异。大多数商业香料化合物没有资格被贴上“天然”的标签，尽管它们在结构上与天然香料相当，因为它们是化学合成的。由于兼容单元操作的高生产成本或缺乏可用来源，生物制备往往受到阻碍。香草风味就是一个很受欢迎的例子，因为全球消费中只有不到1%的香荚兰豆。{昆都，2017 #420；法希，2016 #424}成千上万吨的香兰素是用化学方法生产的，尽管“生物香兰素”正在出现[5]。公众的看法增加了工业过程朝着更可持续性方向发展的压力。然而，从植物中提取往往受到所需化合物的低浓度及其在可变和复杂混合物中的含量的限制。
图1 烷基吡嗪综述。加工最多的烷基吡嗪1 -7。2004年欧洲用作风味剂的吡嗪衍生物的年使用量以公斤/年表示，而*表示欧洲食品中烷基吡嗪的数量，以吨/年[6]表示。特别注意的是化合物1、3、4和8，它们作为商业上可获得的宣称为天然的纯物质，而其他化合物至少是部分化学合成的。临时通知:据我们所知，这些是世界卫生组织和欧洲食品安全局[7]的最新官方卷。非商业合成烷基吡嗪11 -16。
其后果是高昂的提取成本，以及产品线在味道和气味上的变化风险很高。因此，工业研究正转向生物基和/或生物催化策略。如今，某些微生物[8]的使用是众所周知的，并被食品当局[9](EFSA, FDA等)宣布为天然和安全的，并提供了更好的经济可行性，具有温和的反应条件，高特异性和简化的下游工艺，由于更高的纯度，更好的可重复性和持续的来源，例如合成生物学制备和提取。
吡嗪是一种挥发性含氮杂环化合物，广泛分布于植物[10]、昆虫[11]、真菌[12]和细菌[12]中。它们作为一种气味信号来击退捕食者，并有效地防止营养组织或未成熟的水果被吃掉。因此，吡嗪被广泛应用于杀害虫剂、杀昆虫剂、染料和药物化合物中。吡嗪作为生的和烤的食品中的重要成分，受到了食品工业的关注。特别是烷基化吡嗪是重点，因为它们具有强烈的嗅觉特性(图1)。它们可以从土豆、坚果和咖啡等天然来源中提取，应用于许多领域，例如2,3-二甲基吡嗪6(咖啡、坚果味、烘焙味)用于各种饮料和酱汁，而2,5-二甲基吡嗪3(坚果味、霉味、泥土味、烘焙味可可)用于早餐麦片。2,3,5-三甲基吡嗪1(巧克力增强剂)和2,6-二甲基吡嗪4(烘焙，坚果，牛肉)用于与咖啡，可可，肉或土豆一起作为烘焙风味。2-乙基-3-甲基吡嗪2(坚果味、霉味、玉米味、生的、泥土味、油性)用于花生制品、爆米花和面包。可感知的气味取决于物质的稀释度(建议在丙二醇中稀释0.1%或更少)。甲氧基吡嗪主要用于香水工业，改善化妆品和洗漱用品[15]的气味(清新，绿色，木质，琥珀色，东方，麝香，薄荷和草本)。在微波炉食品中经常添加吡嗪香料，因为在温度低于200°C的微波炉中不会形成烘焙气味[16]。
由于甜菜糖蜜中0.01 wt. %吡嗪的天然含量较低，因此，仅靠从天然来源提取和浓缩技术无法满足对上述“天然”烷基吡嗪日益增长的需求[14c, 17]。现代生物技术被认为是一种可持续的经济过程，可以应对未来对“天然”化合物日益增长的需求，并可能进一步增加选择性取代吡嗪的市场需求。
2 .制备相同分子的不同方法
吡嗪是由两分子α-氨基羰基(如氨基酸或氨基糖)缩合而成(美拉德反应)[18]。这两种氨基羰基化合物首先反应生成二氢吡嗪，然后通过空气氧化或消除羟基的芳构化形成侧链。吡嗪可直接从蔬菜、咖啡、可可和坚果等天然来源中提取和少量蒸馏，其中大多数是在咖啡和可可的烘焙过程中故意在高温下形成的[17,19](图3,C)，或在精制过程中无意形成的，如白糖[20]。
图2 反合成分析显示，不同的途径导致相同的分子。不同策略概述：A)从氧化的化学前体开始，通过1,2-二酮胺化和随后二聚/缩合成吡嗪的化学合成。B) 使用转氨酶(ATA-113)结合化学前体和酶胺化合成。
一个已经研究了几个世纪的例子是3-异丁基-2-甲氧基吡嗪，这是葡萄的一种特征气味(图3,C)，由植物由亮氨酸和甘氨酸[21]或亮氨酸酰胺和乙二醛[10]生物合成。已努力鉴定这些假设的前体，但尚未得到最终确认。
一般来说，如果没有合适的催化剂，化学合成无法将两个氨基酸转化为吡嗪核。然而，从1,2-二酮和二胺或氨基酮和氨基醛或其他合成等价物开始是可行的(图2,A)。酶合成可以结合化学前体和酶催化得到最终产物(图2,B)。微生物合成利用天然产生吡嗪的微生物的细胞网络，通过给微生物喂食必要的前体，形成选择性取代的吡嗪(图3,D)。下面总结了化学、生物催化和生物技术的优势和挑战。
图3 反合成分析显示，不同的途径导致相同的分子。不同策略概述：C) 从天然来源(蔬菜、坚果和豆类)提取和蒸馏，重点从氨基酸亮氨酸和甘氨酸中生物合成3-异丁基-2-甲氧基吡嗪；D) 从氨基酸和糖开始，通过体内生物转化合成生物基。
2.1 化学合成
传统吡嗪合成最主要的途径是1,2-二酮在氨存在下反应生成二胺或氨基酮[22]。这样的例子不胜枚举，但一个简单高产的代表性例子是二酮与二胺在甲醇中在室温干燥条件下在叔丁基OK存在下反应5小时，生成70%以上的烷基吡嗪[23]。
2.2 酶法合成
2018年，Turner等人报道了在合适的胺供体存在下，使用氨基转氨酶(S-selective, ta -113, Codexis[24])化学酶法合成取代吡嗪，该酶介导了1,2-二酮前体到α-氨基酮的关键胺化反应，这些α-氨基酮经过氧化二聚成最终产品(图2)[25]。以吡嗪为例，胺基的手性与芳杂环核心的合成无关。所有反应均以异丙胺为胺给体，在室温下进行。72小时后底物被耗尽，吡嗪以纯形式从水相中提取出来，但从环己烷-1,2-二酮和从二乙酰中提取的对称11和非对称12的吡嗪收率仍然在50-65%左右，从戊烷-2,3-二酮中提取的非对称12的吡嗪收率为32%(图1)。副产物形成的原因需要进一步研究，例如在水相中鉴定可能的双胺化副产物或提取问题。萃取后吡嗪核二聚是发生在水缓冲液中还是有机溶剂中，这个问题仍然难以捉摸，需要进一步研究。
一方面，二酮可以通过不同的化学步骤从不同的积木中合成(图2)。另一方面，也有生物选择，因为已知生物途径是通过乙酮10(3-羟基-丁烷-2- 1，图2)。最近的进展是一种“新的”ThDP依赖裂解酶，它能够从更小的亚基中合成乙酮单元，如丙酮酸和活化的乙醛。Pohl等人用来自移动Zymomonas (Zm PDC)和巴氏醋酸杆菌(Ap PDC)的工程PDC，将芳基醛与1)3-氧丁酸和2)烷基醛组合，可获得61-98%的优良产率。同时发表了如何从乙醛中利用SucA [α-酮戊二酸脱氢酶复合物的ThDP依赖E1亚基]从乙醛中获得良好的吡嗪产量)]，或从丙酮酸(3-氧丙酸)与纤维素二糖脱氢酶(CDH)[26]。
在工业生产过程中，成本是决定因素之一。ATAs(例如ATA-113)的价格远高于简单氨的化学胺化。胺化的对映体完整性非常重要，例如对于药物；然而，对于平面杂环的生成，胺化反应的对映选择性是多余的，而缩合反应的高区域选择性是必要的。
在这种情况下，非对称吡嗪可以用ATA-113[25]在一锅法中有区域选择性地合成，而标准的化学合成只能获得对称或非对称吡嗪的混合物。
2.3 生物合成
吡嗪在植物中大量产生，但到目前为止，只有少数细菌被报道能够合成吡嗪，包括假单胞菌、芽孢杆菌、软骨霉菌[27]和链霉菌[28]。
此外，Li et al.(2017)通过基因组分析鉴定出aceti Paenibacillus L14T是一种高效的吡嗪生产者。该菌株从醋酸固态发酵培养基中分离得到，可生产1.6 g/l的吡嗪类化合物，包括2,3-二异丁基吡嗪、2-异丁基-3-甲基吡嗪和1-(5-异丁基-2-吡嗪基)-1-丙烷酮(1.6 g/l)。为了进一步了解，该小组对L14的基因组进行了测序，确定了以缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等前体氨基酸为关键中间体[29]的适合吡嗪生物合成的遗传结构。基因组分析将为进一步利用生物转化法提高选择性和生产力的研究奠定基础。
在自然界中，谷氨酸棒状杆菌会产生少量的三甲基吡嗪1、二甲基吡嗪3,4,6和四甲基吡嗪8，其生物合成与支链氨基酸的代谢有关。Wittmannet等人(2010)通过基因敲除和培养实验的结合表明，从丙酮酸开始，合成Top 7(图1)烷基化吡嗪的生物合成途径需要乙酰乳酸合酶(AS)的活性，并通过乙酰乳酸进行，随后是一系列转胺和氧化步骤，将乙酰乙酮10转化为氨基酮。最后一步是氨基酮缩合并伴随氧化生成吡嗪[30]。
相比之下，Nawrath等人(2010)的一项研究强调了一种不同的路径建议:在黏菌中，吡嗪被提议由分支氨基酸(如缬氨酸)通过还原成缬氨酸并将所产生的氨基醛二聚到13[12]而产生。
Silva-Junior等人最近研究了一种切叶蚁相关的细菌，这种细菌在蚂蚁物种中产生吡嗪作为追踪信息素。该研究提出了粘质沙雷菌3B2中的生物合成途径，导致产生对称的2,5-二甲基吡嗪3，但更重要的是，非对称的3-乙基-2,5-二甲基吡嗪5a都是从L-苏氨酸开始，转化为氨基丙酮。随后，缩合和脱水形成化合物1。在醋酸存在的情况下，脱水发生，同时醋酸加入到C3中，产生羰基，随后羰基被还原和消除，只得到5a[31]。相比之下，天然吡嗪5a只能通过与其区域异构体3-乙基-2,6-二甲基吡嗪5b的混合物从天然来源中提取得到，这强调了这一选择性途径的重要性。
下面两个例子可以为天然α-氨基酸酶促合成吡嗪衍生物提供一些新的策略，根据A) α-氨基醛的二聚和B) α-氨基酮在活细胞中的二聚。
2018年inE进行了一项尝试，试图建立一个使用醛二聚途径的吡嗪生产细胞工厂。利用herqueium[32]的单模，非核糖体肽合成酶HqlA。这种酶将氨基酸(在这种情况下是L-酪氨酸)还原为相应的氨基醛，然后氨基醛二聚生成取代的吡嗪。酸与HqlA的结合消耗ATP，而实际的还原则需要NADPH。
另一种方法最近发表(2020年)，其中荧光假单胞菌SBW25的酶级联被引入大肠杆菌。大肠杆菌产生反应性氨基酮类化合物，可立即二聚生成吡嗪。基因序列包括天然α-氨基酸，4-氨基苯基丙氨酸的合成和其他几个转化非天然对称2,5-二甲基-3,6-双(4-氨基苯基)吡嗪16的基因。该基因簇由4-氨基苯丙氨酸(4APhe) C -乙酰转移酶、二氢吡嗪氧化酶和甲基转移酶[33]组成。
在分离出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)后，Zhang等人于2020年注意到2-乙基-3,5(3,6)-二甲基吡嗪5a/b的潜在工业候选菌株。他们提出了从L-苏氨酸和D-葡萄糖开始的生物合成途径，并通过底物添加和同位素标记实验进行了测试。枯草芽孢杆菌是GRAS，有证据表明在这种生物体[34]中形成了其他有价值的吡嗪。
2.4 工业应用和“天然”认证作为生物基方法的驱动力
最近，越来越多的人呼吁工业的可持续性，特别是在日常消费的食品和健康食品。自21世纪初以来，食用香精和日用香精行业的全球市场增长了两倍。根据一项新的市场研究，该行业在未来五年将以约3.1%的CAGR(复合年增长率)增长，2024年达到305亿美元(2019年达到255亿美元)。除了3.1%的复合年增长率外，天然和有机香料行业的增长速度要快得多，平均年增长率为5.7%，从2019年的68亿美元增长到2026年的110亿美元。这一增长主要是由于全球在食品生产中使用香料的压力，由客户的需求引发，以及通过技术进步提高成本效率，以及随之而来的宣布产品为天然产品的可能性。
欧洲香料法规(EEC No 1334/2008)在第3 (2)c条中定义:“天然调味物质是指通过适当的物理、酶或微生物工艺从植物、动物或微生物来源的材料中获得的调味物质，可以是原始状态，也可以是经过一种或多种传统食品制备工艺加工后供人类食用的调味物质”。
据我们所知，目前还没有申报为天然的用于工业生产的烷基化吡嗪衍生物的生物技术合成注册。因此，从自然资源中提取是获得天然吡嗪的唯一途径。
2.5 结论
近几十年来，许多不同的细菌和酶合成天然食用香料和日用香料的过程已经在文献中描述。由于成本驱动的饮料和食品行业存在很高的壁垒，这些工艺很少能进行大规模工业生产。
在烷基吡嗪的情况下，不断增长的需求不再能够经济地从自然来源供应。
如上所述，消费者不能再满足于商业化学合成，对化石石油化学品的依赖正成为一个至关重要的负面因素。工程微生物的生产，如假单胞菌sp.，芽孢杆菌sp.，软骨真菌sp.和链霉菌sp.为未来的小型体内工厂提供了可能性。到目前为止，通过基因敲除或基因转移到其他生物中鉴定和修饰产生吡嗪的菌株，可以产生几种类型的吡嗪。然而，这些系统太不具体，产生了许多不同的产品。与传统化学相比，细胞工厂更难以优化，传统化学通常只获得一个主要产品和很少的副产物。近年来，对大肠杆菌合成吡嗪的异源基因在体内的优化进行了较为深入的研究。然而，到目前为止，产品范围非常有限，与7种最需要的烷基吡嗪关系不大。对于这7个化合物，还需要设计智能路线。虽然工业将继续改进运行过程，但技术科学的学术发展将扩大化学和微生物学的互补领域，在未来几十年提供商业上负担得起的和可持续的产品。
原文出处：
Frederik Mortzfeld, Chiam Hashem, Kvetka Vrankova, et al. Pyrazines – valuable flavour & fragrance compounds: Biocatalytic synthesis and industrial applications. Authorea. April 24, 2020.DOI: 10.22541/au.158775683.32679686